Secuenciación

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Secuenciación en la Ciencia Forense

Las técnicas de análisis molecular son una parte vital de la ciencia forense. El análisis del material genético es fundamental para detectar microorganismos patógenos (causantes de enfermedades) y para identificar a una víctima o implicar a un sospechoso.

Estos exámenes moleculares se basan en la determinación de la disposición de los bloques de construcción del material genético. Esta determinación se llama secuenciación.

La secuenciación se refiere a las técnicas utilizadas para determinar el orden de las bases constitutivas (por ejemplo, adenina, timina, guanina y citosina) del ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o los bloques de construcción de proteínas de los aminoácidos constituyentes.

El ADN suele secuenciarse por varias razones, como la determinación de la secuencia de la proteína codificada por el ADN, la ubicación de los sitios en los que las enzimas de restricción pueden cortar el ADN, la ubicación de los elementos de la secuencia del ADN que regulan la producción de ARN mensajero (ARNm), o para detectar alteraciones en el ADN.

La secuenciación del ADN se logra deteniendo el alargamiento de una cadena de ADN en una base conocida y en un lugar conocido del ADN. Prácticamente, esto se puede hacer de dos maneras.

PROCEDIMIENTO SANGER-COULSON
En el primer método, denominado procedimiento Sanger Coulson, se incorpora una pequeña cantidad de una base específica llamada dideoxinucleósido en una mezcla con las otras cuatro bases normales. Esta base es ligeramente diferente de la base normal y está marcada radioactivamente. La base radioactiva se incorpora a la cadena de ADN en crecimiento en lugar de la base normal, y el crecimiento del ADN se detiene. Esta detención se hace cuatro veces, cada vez usando uno de los cuatro dideoxinucleósidos diferentes. Esto genera cuatro colecciones de moléculas de ADN.

Otros Elementos

Además, debido a que la replicación del ADN siempre comienza en el mismo punto, y porque la cantidad de base alterada añadida es baja, para cada reacción se generarán muchos trozos de ADN de diferentes longitudes. Cuando la muestra se utiliza para la electroforesis en gel, los trozos de diferente tamaño pueden resolverse como bandas radioactivas en el gel. Entonces, conociendo la ubicación de las bases, se puede deducir la secuencia del ADN.

Algunos Aspectos sobre Secuenciación

TÉCNICA MAXAM-GILBERT
La segunda técnica de secuenciación de ADN se conoce como la técnica Maxam Gilbert, por sus codescubridores.Entre las Líneas En esta técnica, ambas cadenas de ADN de doble cadena se etiquetan radioactivamente usando fósforo radiactivo. Al calentarse, las cadenas de ADN se separan y pueden distinguirse físicamente entre sí, ya que una cadena es más pesada que la otra. Ambas cadenas se cortan con enzimas específicas y los fragmentos de diferente tamaño de ADN se separan por electroforesis en gel. Basándose en el patrón de fragmentos, se determina la secuencia de ADN.
COMPARANDO LOS MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
Hace varias décadas, la secuenciación implicaba el escrutinio de los geles a ojo.

Puntualización

Sin embargo, el matrimonio de un poderoso hardware y software de computación con el proceso de secuenciación ha automatizado el procedimiento.

El enfoque de Sanger Coulson es el método más popular. Se han desarrollado varias modificaciones y se ha automatizado para una secuenciación a gran escala. Durante la secuenciación del genoma humano, se utilizó con mucho éxito un método de secuenciación llamado secuenciación por escopeta. La secuenciación por escopeta se refiere a un método que utiliza enzimas para cortar el ADN en cientos o miles de bits aleatorios. Son necesarios tantos fragmentos, ya que las máquinas de secuenciación automatizada sólo pueden descifrar fragmentos relativamente cortos de ADN de unas 500 bases de largo. Las muchas secuencias se vuelven a unir usando computadoras para generar la secuencia completa del genoma de ADN.

La secuenciación de la proteína implica la determinación de la disposición de los bloques de construcción de aminoácidos de la proteína. Es común secuenciar una proteína determinando la secuencia de ADN que codifica la proteína.

Puntualización

Sin embargo, esto sólo es posible si se dispone de un gen clonado. Todavía se da a menudo el caso de que la secuenciación química de la proteína, tal como se describe posteriormente, debe realizarse para fabricar una sonda de oligonucleótidos que pueda utilizarse luego para localizar el gen objetivo. La técnica más popular de secuenciación química directa de proteínas que se utiliza hoy en día es el procedimiento de degradación de Edman. Se trata de una serie de reacciones químicas que eliminan un aminoácido a la vez de un determinado extremo de la proteína (el amino terminal). Cada aminoácido que se libera ha sido modificado químicamente en la reacción de liberación, lo que permite detectar el producto liberado mediante una técnica llamada cromatografía de fase inversa. La identidad de los aminoácidos liberados se determina secuencialmente, produciendo la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Basado en la experiencia de varios autores, mis opiniones, perspectivas y recomendaciones se expresarán a continuación (o en otros lugares de esta plataforma, respecto a las características en 2026 o antes, y el futuro de esta cuestión):

Desarrollo

Otra técnica de secuenciación de proteínas se llama espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido, o FAB-MS. Esta es una poderosa técnica en la que la muestra es bombardeada con un flujo de átomos rápidos, como el argón. La proteína se carga y se fragmenta de una manera específica de la secuencia. Los fragmentos pueden ser detectados y su identidad también puede ser determinada, aunque el gasto y la relativa escasez del equipo necesario puede ser una limitación para la técnica.

Otra estrategia de secuenciación de proteínas es la digestión de la proteína con enzimas especializadas en la degradación de proteínas, llamadas proteasas. Los fragmentos más cortos que se generan, llamados péptidos, pueden ser secuenciados. El problema entonces es ordenar los péptidos. Esto se hace mediante el uso de dos proteasas que cortan la proteína en diferentes puntos, generando péptidos superpuestos. Los péptidos se separan y secuencian, y se pueden deducir los patrones de superposición y la secuencia de proteínas resultante.
Revisión de hechos: Robert [rtbs name=”ciencia-forense”]

Recursos

Secuenciación en Inglés

Una traducción de secuenciación al idioma inglés es la siguiente: Sequencing.

Véase También

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